1、各型急性白血病，特别是急性淋巴细胞白血病；恶性淋巴瘤，非何杰金淋巴瘤和蕈样肉芽肿，多发性骨髓瘤。
2、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌。
3、头颈部癌、支气管肺癌、各种软组织肉瘤；
4、高剂量用于骨肉瘤，鞘内注射可用于预防和治疗脑膜白血病以及恶性淋巴瘤的神经侵犯，本品对银屑病也有一定疗效。

本品可供静脉、肌肉、动脉、鞘内注射，每瓶5mg的冻干粉针用大约2ml注射用水重溶为2.5mg/ml的浓度，每瓶0.1g的冻干粉针用大约4ml注射用水重溶为25mg/ml的浓度，每瓶1g的冻干粉针用大约20ml注射用水重溶为50mg/ml的浓度。如有需要可用无菌和不含防腐剂的溶媒进一步稀释使用，如注射用氯化钠溶液或5%葡萄糖溶液。

当大剂量静脉给药时，适宜用5%葡萄糖注射液稀释。

当鞘内注射给药时，适宜用无菌和不含防腐剂的溶媒，例如注射用氯化钠溶液将重溶液进一步稀释到1mg/ml的浓度给药，规格5mg的经常用于鞘内注射。
1、肌肉或静脉注射  成人一次10～50mg，每周1～2次；儿童每日20～30mg/m²，每周一次；或视骨髓情况而定。
用于急性白血病：肌肉或静脉注射，每次10～30mg，每周1～2次。

用于绒毛膜上皮癌或恶性葡萄胎：每日10～20mg，亦可溶于5%或10%的葡萄糖注射液500ml中静脉滴注，一日1次，5～10次为一疗程。总量80mg～100mg。

用于实体瘤，静脉一般20mg/m²/次；亦可介入治疗。
甲氨蝶呤大剂量疗法：每次1～5g/m²，4～6小时滴完。自用药前1日开始至用药后1～2日每天补液3000ml，并用碳酸氢钠碱化尿液，每日尿量不少于2000ml。开始用药后24小时起每6小时给予亚叶酸15mg（10mg/m²），共用10次或直至甲氨蝶呤血药浓度降至5×10^-8mol/L以下（也可见下表）：
大剂量甲氨蝶呤给药后亚叶酸用药指导剂量